【正题名】:未培养微生物来源的纤维素酶功能基因的筛选

　　　　【作者】:王凤超

　　　【出版年】:2008

　　　　【页码】:p.1-84

　　　【总页数】:84p

　　【授予学位】:硕士

【授予学位单位】:山东大学

　　【导师姓名】:刘巍峰;陈冠军

　　【研究专业】:微生物学

　　　【馆藏号】:Y1351813

　　　【分类号】:Q936; X172

　　　【关键词】:未培养微生物; 纤维素酶; 功能基因筛选; 酶活性筛选; 纤维素降解; λ噬菌体

　　【正文语种】:CHI

　　　　【文摘】:纤维素是由吡喃型D-葡萄糖以β-1-4-糖苷键连接而成的直链状大分子，是地球上含量最丰富的生物质资源。随着社会经济的发展，生物质资源的利用越来越受到人们的重视。在自然界中，有很多微生物都能产生将纤维素降解转化为葡萄糖的纤维素酶，而葡萄糖可以进一步作为发酵生产包括乙醇在内的化学基产品原料；同时，纤维素酶在饲料添加剂，纺织，造纸等行业也有着广阔的应用前景。但是，已知的纤维素酶普遍存在着活力不高，效率较低，发酵生产成本比较高的缺点，限制了纤维素酶的大规模工业化应用。因此，有必要筛选新型高效纤维素酶。目前，通过传统的微生物筛选方法所获得的产纤维素酶菌株大多为已知菌种，筛选到新菌种的几率很低。另一方面，在自然界中存在着大量的未培养微生物(>99％)，而某些特殊生境的微生物有可能产生高效降解纤维素的酶或酶系。通过提取并纯化特定环境样品中微生物的总DNA，进而构建环境基因组文库，并从构建的各种基因组文库中筛选新的纤维素酶基因，为纤维素酶的筛选提供了一条新的筛选途径。本论文以λ噬菌体(Stratagene)为载体成功构建了四川九寨沟森林土壤、东营市某屠宰厂的牛瘤胃液、济南市动物园亚洲象的新鲜排泄物以及取自新疆喀纳斯的腐烂木材等环境的基因组文库，文库分析发现其外源插入DNA片段有很好的随机性，文库的容量达到了实验筛选的需求。通过相关纤维素酶活性筛选的方法对所构建文库进行了初步筛选，得到了5个新的内切纤维素酶基因和2个新的β-葡萄糖苷酶基因。基因序列显示，它们与GenBank中已知的纤维素基因不仅在核苷酸水平上没有明显的同源性，而且其编码产物与已知的纤维素酶在氨基酸水平上的一致性低于50％，相似性低于70％，说明筛选到的纤维素酶基因为新的纤维素基因，证明了环境基因组学研究方法在筛选新纤维素酶基因，尤其是未培养微生物来源的纤维素酶方面的可行性。同时，研究结果也表明相关的纤维素酶系广泛存在于诸如森林土壤、牛瘤胃液及大象排泄物等环境中。对所分离纤维素酶的氨基酸序列进一步分析表明，其中四个内切纤维素酶属于糖苷水解酶第5家族，另一个内切纤维素酶属于糖苷水解酶第9家族，但它们只含有相应家族糖苷水解酶的催化结构域，而不包含CBM区，推测原因可能是含有CBM区的纤维素酶基因不能在大肠杆菌体系中正确地折叠表达，因而无法用活性筛选的方法得到这些基因。所筛选获得的两个β-葡萄糖苷酶均属于糖昔水解酶第3家族，它们均含有糖苷水解酶3C功能域和糖苷水解酶3功能域。遗传进化树分析结果表明，这些纤维素酶与所属家族的纤维素酶处于相邻的分支上。但对这些纤维素酶粗酶液的初步分析结果显示，与同家族的已知纤维素酶相比，目前尚未发现其存在某些特殊的催化特性。总之，本论文成功构建了多个环境样品的基因组文库，并从中筛选克隆到了新的纤维素酶基因，相关结果验证了环境基因组学研究方法在筛选新纤维素酶基因，尤其是未培养微生物来源的纤维素酶方面的可行性，为进一步的大规模筛选奠定了基础；论文所建立的方法也可以用于通过环境基因组学的方法筛选其它活性产物的工作。同时，论文工作也预示了环境基因组学功能活性筛选与其它分析方法相结合在阐述复杂生境催化体系中结构组成及其变化中的重要性。