【正题名】:棉纤维发育相关的细胞壁蛋白基因克隆及其表达调控和亚细胞定位分析

　　　　【作者】:黄耿青

　　　【出版年】:2008

　　　　【页码】:p.1-135

　　　【总页数】:135p

　　【授予学位】:博士

【授予学位单位】:华中师范大学

　　【导师姓名】:李学宝

　　【研究专业】:植物学

　　　【馆藏号】:Y1290690

　　　【分类号】:Q943; Q344.13

　　　【关键词】:棉纤维发育; 基因克隆; 富含脯氨酸蛋白; 启动子活性; 亚细胞定位; 过量表达

　　【正文语种】:CHI

　　  【文摘】:棉花纤维是由胚珠部分表皮细胞分化形成的高度伸长不分支的单细胞表皮毛，它不仅是世界上重要的纺织原料，也是一个研究细胞伸长、细胞壁发生和纤维素合成的独特的实验系统。棉花纤维的发育可分为4个连续的发育阶段：(1)纤维起始；(2)细胞伸长；(3)次生细胞壁的沉积；(4)脱水成熟。本研究以我国重要的经济作物棉花作为实验材料，分离和克隆了4个在棉花纤维中特异表达的细胞壁蛋白基冈，并对它们的表达调控、细胞亚定位进行了研究。研究结果如下：1．利用Macroarray的方法，分离和鉴定了12个棉花纤维发育相关的细胞壁蛋白基因，其中包括4个extensins、7个PRPs和1个GRP。RealtimeRT-．PCR结果显示3个GhPRPs在纤维中特异表达。我们选取其中2个GhPRP3和GhPRP5做进一步的研究，序列分析表明GhPRP3cDNA包含333bp的开放阅读框，编码一个111个氨基酸的蛋白质。GhPRP5cDNA包含546bp的开放阅读框，编码一个182个氨基酸的蛋白质。这两个基因编码的蛋白之间同源性较低，而且，BlastP分析发现GhPRP3、GhPRP5与其它植物PRP的同源性都很低，含有新的结构单元，推测是新类型的PRPs。RealtimeRT—PCR和Northernblotting分析表明，这两个基因均在棉花纤维中特异表达并受棉花纤维发育阶段的调控。2．利用本实验室已克隆的．FLAcDNA序列以及棉花公共EST库资源，分离鉴定了19个棉花FLAs基因。这些基因编码的蛋白质具有以下特点：N-端具有信号肽序列，含有1—3个AGP结构域和1．2个类成束蛋白结构域。其中的15个GhFLA蛋白在其C-端含有糖基磷脂酰肌醇锚定位点。根据这些特点和它们间的系统进化关系，可以把它们分为四个亚类。Real—timequantitativeRT-PCR分析表明，GhFLA基因在棉花不同组织中差异表达。其中，3个基因(GhFLA1／2／4)在10DPA纤维中特异或者优势表达，4个基因(GhFLA6／14／15／18)在10DPA纤维中表达量较高。GhFLA5，GhFLA8和GhFLA9在叶片中表达最高，而其它FLA基因在棉花下胚轴中优势表达。研究结果还表明，在棉纤维中高效或者特异表达的7个基因，其表达也受纤维发育阶段的调节。应用离体胚珠培养技术，研究这几个基冈在多种植物激素和NaCI胁迫下表达模式，结果显示FLAs基因的表达受到植物激素和NaCl的调节。上述结果显示一些GhFLAs, , , 与棉纤维发育相关，而且受植物激素以及和盐胁迫调节。3．采用GenomewalkerPCR方法，分离了GhPRP3、GhPRP5、GhFLA1和GhFLA4基因的启动子序列，命名为pGhPRP3、pGhPRP5、pGhFKA1和pGhFLA4。用Plantcare分别对这四个启动子的顺式作用元件进行预测，发现每个启动子中都含有很多真核生物顺式元件的同源序列，如与光应答有关的元件、与激素响应相关的元件、与非生物胁迫应答相关的元件等等。构建了启动子：GUS融合表达载体，并通过农杆菌介导的方法转化烟草和拟南芥，获得一批转基因植株。组织化学分析表明，在pGhFIAl启动子的驱动下，GUS基因在茎维管组织、叶脉和叶柄以及烟草种子表皮中表达，且Gus信号的强度与种子的发育相关；另外，也观察到Gus在部分转基因植株叶柄的表皮毛中表达。pGhFLA4启动子在拟南芥茎、荚果中具有表达活性，且在伤诱导下其表达活性加强。此外，其它两个基冈的启动子：：GuS融合载体已经导入烟草和拟南芥，获得转基因植株，有关分析正在进行中。4．利用eGFP报告基因，构建基因与eGFP的融合表达载体，研究了GhFIAl和GhFLA4的亚细胞定位。将GhFLA1：：GFP和GhFLA4：：GFP导入棉花，获得转化愈伤组织。利用激光共聚焦显微技术，观察该融合蛋白的细胞亚定位情况，结果表明，这两个蛋白均定位在细胞膜外膜上。5．利用RNAi技术和过量表达米研究GhFLA1和GhPRP3基因的功能。构建了这两个基因的过量表达载体和RNAi载体，通过农杆菌介导植物转化法，转化棉花和烟草，得到12个GhPRP3过量表达的转基因烟草株系和14个GhFIAl的转基因烟草株系。另外，获得5个过量表达GhFLA1基因的转基冈棉花株系，有关RNAi技术转化棉花的_T作也在进行中。