【正题名】:棉花PIP基因和HB基因的克隆鉴定、表达分析及转基因研究

　　　　【作者】:吴雅洁

　　　【出版年】:2008

　　　　【页码】:p.1-67

　　　【总页数】:67p

　　【授予学位】:硕士

【授予学位单位】:华中师范大学

　　【导师姓名】:李学宝

　　【研究专业】:生物化学与分子生物学

　　　【馆藏号】:Y1289564

　　　【分类号】:Q78:S562

　　　【关键词】:棉花; 转基因作物; 水孔蛋白; 基因调控机制

　　【正文语种】:CHI

　　  【文摘】:棉花是一种全球性的重要经济作物，也是最主要的纺织纤维作物，全世界约有1.8亿人从事与棉花生产有关的活动。棉花是我国重要的农产品和纺织原料，在国民经济发展中占有十分重要的地位。稳定和提高棉花质量，成为提高我国纺织品国际市场竞争力的重要内容。转基因棉花是我国唯一获准生产的转基因作物。利用基因工程改良棉花的产量和品质，首先必须清楚棉花生长发育过程的分子机制。因此，对棉花发育相关基因的分离鉴定、表达调控，并弄清棉花发育过程基因的协同作用，系统地解析棉花生长发育调控的分子机理，对于提高棉花产量和改良品质具有重要的理论意义和实践价值。PIP类蛋白是一类定位在细胞质膜的水孔蛋白，能选择性地高效运转水分子。研究棉花水孔蛋白基因功能表达与调控，对于阐明棉花等植物水分代谢的分子机制，具有重要的生物学理论意义和农业应用价值。另一方面，同源异型域一亮氨酸拉链蛋白(homeodomain—leucinezipperprotein，HD—Zip)是高等植物中特有的一类转录因子。研究表明，HD—zip对植物的早期发育起到至关重要的作用。研究homeobox基因在棉花发育过程中的功能与调控作用，将有助于深入了解棉花早期发育的基因调控机制，利于改良棉花品种以提高产量。我们从棉花中分离出3个编码PIP基因和一个编码HD—Zip蛋白的HB(homeobox)基因，本文主要对这几个基因及其编码蛋白结构、表达谱及转基因进行分析，结果如下：1.从棉花cDNA文库中分离筛选出三个编码PIP类水孔蛋白cDNAs，分别被命名为GhPIP2；3GhPIP2；4和GhPIP1:6.GhPIP2；3全长1239个碱基，编码278个氨基酸的蛋白质；GhPIP2；4全长1211个碱基，编码278个氨基酸的蛋白质，它与GhPIP2；3都属于PIP2类，它们编码的蛋白质同源高达98％；6hPIP1:6全长1211个碱基，编码289个氨基酸的蛋白质。2.Northern杂交分析表明6hPIP2；3和6hPIP2；4的表达模式很相似，主要在纤维的快速伸长期(5DPA—15DPA)大量表达，在10DPA和12DPA纤维中的表达强度达到峰值。Northern杂交还检测到GhPIP2；3在下胚轴中有很强的表达，GhPIP2；4在这个组织中有适度的表达。同时，它们在根、子叶、花瓣和胚珠中都有微弱的表达，但是在叶片和花粉中几乎不表达。我们分离的两个基因GhPIP2；3和GhPIP2；4属棉纤维优势表达的水通道蛋白基因，它们在纤维伸长期大量积累，可能参与了纤维的伸长发育。3.为了进一步了解GhPIP2；3和GhPIP2；4在棉花中的功能，利用DNA重组技术，将这两个基因分别克隆到pBl121质粒中，构建了过量表达载体(overexpressionvector)对拟南芥进行浸花法转化，收获到转基因植株，以待分析这两个编码水孔蛋白基因的功能。RNA干扰(RNAi)技术阻断基因的表达，是研究基因功能的有效途径。为研究水通道蛋白在棉花中的功能，我们构建了GhPIP1；6的RNAi载体来转棉花，经过多次继代培养，已经获得转基因棉花植株。有关GhPIP1；6基因在转基因棉花中的功能有待进一步研究探讨。4.本实验室在先前的研究中从棉cDNA文库中分离克隆到1个Homeobox基因，编码HD-Zip转录因子，命名为GhHB3。利用实时荧光定量PCR对该基因的表达谱进行分析，发现该基因在棉花各个组织中均有表达，其中在下胚轴中表达量相对最高。利用DNA重组技术，构建了过量表达载体和RNAi载体，进行棉花的遗传转化，得到具有km抗性的棉花再生苗。经过分子生物学鉴定(PCR扩增)，获得GhHB3基因超量表达和RNA干扰抑制表达的转基因棉花植株。在超量表达的转基因植株中，GhHB3基因的表达水平比野生型棉花中的表达水平高，通过对GhHB3超量表达转基因棉花的营养生长变异进行观测，结果表明GhHB3超量表达的转基因棉花的植株侧枝变短增多、顶端优势减弱，叶片变小，侧根数量变少，如果不用嫁接的方式几乎不能存活。而在RNA干扰抑制表达的转基因植株中，内源GhHB3基因的表达水平比野生型棉花中的表达水平低，基因表达几乎完全沉默。通过对RNAi的转基因棉花的营养生长变异进行观测，发现RNAiGhHB3转基因棉花的植株矮化，营养体不能进一步发育成熟。对过量表达植株的叶片进行切片观察，发现叶片维管组织发育有缺陷，且叶片细胞没有发生相应的分化。因此，推测该基因可能参与棉花营养器官发育的调控。