【作者】:王艺红

　　　【出版年】:2008

　　　　【页码】:p.1-63

　　　【总页数】:63p

　　【授予学位】:硕士

【授予学位单位】:华南农业大学

　　【导师姓名】:林俊芳

　　【研究专业】:微生物学

　　　【馆藏号】:Y1277361

　　　【分类号】:Q949.32; S646.13

　　　【关键词】:多功能纤维素酶; 草菇; 遗传转化; 低温筛选; 基因表达

　　【正文语种】:CHI

　　　　【文摘】:纤维素酶(Cellulase)是指能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶在食品加工、饲料、纸浆漂白、洗涤、纺织、酿造发酵等方面具有广阔的应用前景。多功能纤维素酶基因(multi-functionalcellulasegene，mfc)是从福寿螺胃组织中克隆得到的，具有外切-β1，4-葡聚糖酶，内切β-1,4-葡聚糖酶和木聚糖酶的活性。草菇(Volvariellavalvacea)是高等大型真菌，能够较好修饰并加工表达产物，维持表达蛋白的活性，可克服原核生物和低等真核生物酵母的表达缺陷。因此利用草菇作为mfc基因的表达宿主表达多功能纤维素酶，同时解决草菇分解纤维素能力低(生物转化率低)的难题将具有重要的科学理论意义及良好的应用前景。本研究构建含有草菇gpd-Vvs内源启动子和多功能纤维素酶基因的表达载体，采用PEG介导的原生质体法遗传转化草菇菌丝原生质体，成功获得含有多功能纤维素酶基因的转基因草菇；同时，测定了转基因草菇的多功能纤维素酶活性。主要结果如下：(1)采用草菇内源启动子gpd-Vvs，构建含有多功能纤维素酶基因的表达载体pgVvs-mfc用于草菇菌丝原生质体的转化。(2)确定了草菇V23原生质体再生菌丝在0℃低温下的致死时间为120h。(3)利用PEG介导的原生质体转化方法，将所构建的pgVvs-mfc质粒与含有抗冷冻蛋白基因afp的pvg-afp质粒共转化草菇V23菌株原生质体，通过0℃低温筛选获得了拟转化子。拟转化子经PCR和Southern杂交鉴定，结果表明了7个转化子的基因组中整合了mfc基因。(4)对7个转基因菌株的多功能纤维素酶活性测定结果表明：转基因草菇的酶活均显著高于CK对照，其中TVM23-8的CMC酶活最高，比对照提高了70.31％；TVMM23-13CMC酶活最小，也比对照高出32.22％；TVM23-3的PFA酶活提高最大，比对照高出76.94％；TVM23-13的PFA酶活最小，也比对照高出23.79％。这些结果说明多功能纤维素酶基因在草菇中获得了表达，表达量存在显著的差异。(5)观察转基因草菇菌丝与对照菌丝在棉籽壳培养基上的菌丝生长速度并进行方差分析，结果表明；转基因草菇TVM23-9、TVM23-13和TVM23-14在棉籽壳培养基上的菌丝生长速度与对照存在显著性差异，进一步说明了整合进革菇基因组中的mfc基因提高了草菇分解纤维素的能力，从而提高了草菇菌丝的生长速度。(6)经过出菇实验，转基因草菇TVM23-3、TVM23-5、TVM23-7、TVM23-8、TVM23-9和TVM23-14在栽培盆中的菌丝生长速度较V23-CK快，原基数目、所形成的小菇蕾数目均多于V23-CK，子实体形成多、产量比V23-CK高，其中TVM23-9的子实体产量提高83.33％，TVM23-14产量提高91.67％。(7)对F1代转基因草菇TVM23-3和TVM23-9的担孢子进行单孢分离，获得了50个单孢菌株。这些单孢菌株通过PCR鉴定，结果表明：3株单孢菌株的基因组中仍然整合有mfc基因，47株单孢菌株没有，咖基因存在。说明mfc目的基因在草菇担孢子形成过程(有性过程)中存在分离现象。